צביעת גראם היא טכניקה מהירה ומשמשת לראות את נוכחותם של חיידקים בדגימת רקמה ולסווג את החיידקים כגראם חיוביים או גראם שליליים, בהתבסס על התכונות הכימיות והפיזיקליות של קירות התא שלהם. כתם גראם משמש כמעט תמיד כצעד הראשון באבחון זיהום חיידקי.
טכניקת מכתים זו נקראת על שם המדען הדני הנס כריסטיאן גראם (1853 - 1938), שפיתח את הטכניקה בשנת 1882 ופרסם אותה בשנת 1884 כטכניקה להבחנה בין שני סוגים של חיידקים בעלי תסמינים קליניים דומים: Streptococcus pneumoniae (הידוע גם בשם Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) והחיידקים Klebsiella pneumoniae.
שלב
שיטה 1 מתוך 3: הכנת שקופית המיקרוסקופ
שלב 1. היכונו לעבודה במעבדה
לבשו כפפות ועניבה ארוכה לשיער כדי למנוע זיהום חיידקי של הדגימה שאתם בודקים. נקו את סביבת העבודה מתחת למכסה מנוע, או באזור אחר מאוורר היטב. בדוק את מבער Bunsen וודא שהמיקרוסקופ פועל כראוי לפני שתתחיל.
שלב 2. לעקר את השקופית זכוכית מיקרוסקופ
אם מגלשת הזכוכית מלוכלכת יש לשטוף אותה במי סבון כדי להסיר שמן ולכלוך. נקו את השקופיות באתנול, במנקה זכוכית או בשיטה אחרת בה משתמשת המעבדה שלכם.
שלב 3. מניחים את הדגימה על גבי שקופית הזכוכית
אתה יכול להשתמש בטכניקת כתם הגראם כדי לסייע בזיהוי חיידקים בדגימה רפואית, או תרבות של חיידקים הגדלים בצלחת פטרי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בכתם גראם על משיכות דקות של המדגם. רצוי להשתמש בדגימות בנות פחות מ -24 שעות, מכיוון שחיידקים מבוגרים יותר עלולים לפגוע בדפנות התא שלהם ולא יגיבו להכתמת גראם.
- אם משתמשים בדגימת רקמות, מוסיפים 1-2 טיפות לשקופית זכוכית. מורחים באופן שווה על השקופית ליצירת שכבה דקה של פיזור דגימה, על ידי הזזה באמצעות קצה השקופית הזכוכית הסטרילית השנייה. תן לזה להתייבש לפני שאתה עושה את השלב הבא.
- אם אתה לוקח חיידקים מצלחת פטרי, עקר את לולאת החיסון במבער בונסן עד שהוא זוהר, ואז תן לו להתקרר. השתמש בלולאה כדי לטפטף מים סטריליים לשקופית, ואז לעקר ולצנן שוב לפני השימוש בו כדי לאסוף דגימה קטנה של חיידקים. אחרי זה מערבבים בעדינות.
- יש לערבב שוב את החיידקים שהוכנו במרק בעזרת מערבולת, ואז לקחת אותם עם לולאת החיסון כמפורט לעיל, מבלי להוסיף מים.
- אם יש לך דגימת ספוגית (בדרך כלל בעזרת ידית קטנה עם קצות כותנה), גע וסיבוב בעדינות את המקלון מעל השקופית.
שלב 4. טמפרטורה מעט גבוהה יכולה לגרום למריחה טובה
החום יחזיק את החיידקים על גבי השקופית, כך שהם לא יתמוססו בקלות במהלך תהליך ההכתמה. הקש במהירות על השקופית פעמיים עד שלוש מעל מבער בונסן, או לחמם את השקופית מעל מחמם חשמלי. אין לחמם יותר מדי, הדגימה עלולה להינזק. אם אתה משתמש במבער Bunsen, היא צריכה להיות להבה קטנה אך כחולה במקום להבה כתומה גדולה.
לחלופין, ניתן לבצע מריחה גם עם מתנול, על ידי הוספת 1-2 טיפות מתנול למריחה יבשה, ייבוש המתנול הנותר בשקופית על ידי השארתו באוויר הפתוח. טכניקה זו ממזערת את הנזק לתא ומספקת רקע תמונת שקופיות נקייה
שלב 5. מקם את השקופית מעל מגש הצביעה
מגשי מכתים עשויים ממתכת, זכוכית או פלטות פלסטיק רדודות עם רשת רכה על הדף. הניחו את השקופיות על גבי הרשתות הללו, כך שניתן יהיה לנקז את הנוזל בו אתם משתמשים למגש.
אם אין לכם מגש צביעה, תוכלו להניח שקופית על מגש פלסטיק להדפסת קוביות קרח
שיטה 2 מתוך 3: תהליך כתם גרם
שלב 1. יוצקים את הנוזל הסגול הקריסטלי על המריחה
השתמש בפיפטה כדי לרסס דגימת חיידקים בכמה טיפות של צבע סגול קריסטל, המכונה גם סגול ג'נטיאן. השאירו אותו למשך 30-60 שניות. סגול קריסטל (KV) נפרד בתמיסה מימית ליונים KV+ וכלוריד (Cl-). יונים אלה חודרים לדפנות התא ולממברנות התא של חיידקים חיוביים גרם ושלילי גרם. יון KV+ מתקשר עם המרכיבים הטעונים שלילית של תאי החיידקים, ומעניק לתאים צבע סגול.
מעבדות רבות משתמשות בסגול קריסטל "האקר", המכיל אמוניום אוקסלט כדי למנוע משקעים
שלב 2. שוטפים את סגול הקריסטל בעדינות
הטה את השקופית והשתמש בבקבוק מכונת כביסה כדי לרסס זרם קטן של מים מזוקקים או מהברז מעל השקופית. מים צריכים לזרום על פני המריחה, ואין לרסס אותם ישירות על המריחה. אין לשטוף יתר על המידה. זה יכול להסיר כתמים בחיידקים חיוביים גרם.
שלב 3. שטפו את המריחה ביוד, ולאחר מכן שטפו
השתמש בטפטפת כדי לשטוף את המריחה ביוד. השאירו אותו לפחות 60 שניות, ולאחר מכן שטפו בזהירות באותו אופן.) בשכבות הפנימיות והחיצוניות של התא. מכלול תרכובות זה ישמור על הצבע הסגול של סגול הגביש שבתוך התא, במקומות המוכתמים.
יוד הוא חומר מאכל. הימנע משאיפה, בליעה או מגע עם העור
שלב 4. הוסף אקונומיקה צבעונית, ולאחר מכן שטוף במהירות
בדרך כלל משתמשים בתערובת של 1: 1 של אצטון ואתנול לשלב חשוב זה, אותו יש לתזמן בקפידה. מקם את השקופית בזווית מסוימת, ולאחר מכן הוסף אקונומיקה צבעונית עד שלא ייראה סגול יותר במים המשמשים לשטיפה. זה בדרך כלל לוקח פחות מעשר שניות, או אפילו פחות זמן אם האקונומיקה מכילה ריכוז גבוה של אצטון. עצור את השלב הזה באופן מיידי, אחרת הצבע ישלוף גם סגול קריסטל מהתאים החיוביים-שליליים, ויש לחזור על תהליך הצביעה. שטפו מיד כל אקונומיקה בצבע עודף באמצעות הטכניקה הקודמת.
- אצטון טהור (95%+) יכול לשמש כתחליף. ככל שתשתמשו יותר אצטון כך האקונומיקה תעבוד מהר יותר ולכן עליכם להקדיש יותר תשומת לב לתזמון.
- אם אתה מתקשה לעקוב אחר הזמן לשלב זה, הוסף אקונומיקה צבעונית טיפה אחר טיפה.
שלב 5. מפזרים את הצבע הנגדי על המריחה ולאחר מכן שוטפים
כתם נגדי, בדרך כלל ספרנין או פוקסין, משמש להגדלת הניגודיות בין חיידקים גרם שליליים לגרמים חיוביים, על ידי צביעת חיידקים דהוי (דהוי), כלומר חיידקים גרם שליליים, ורודים או אדומים. השאירו למשך 45 שניות לפחות, ואז לשטוף.
פוקסין יכתים באופן אינטנסיבי חיידקים גרם שליליים רבים, כגון Haemophilus spp ו- Legionella spp. שיטה זו טובה למתחילים
שלב 6. יבש את השקופית
אתה יכול לייבש אותם באוויר הפתוח לייבוש, או לייבש אותם באמצעות נייר ביבלי שנמכר למטרה זו. תהליך צביעת הגראם הושלם.
שיטה 3 מתוך 3: בדיקת תוצאות הצביעה
שלב 1. הכינו את מיקרוסקופ האור
מניחים את השקופית מתחת למיקרוסקופ. החיידקים משתנים מאוד בגודלם, כך שההגדלה הכוללת הנדרשת תשתנה בין 400x ל- 1000x. עדשה אובייקטיבית עם שמן טבילה מומלצת לתמונה חדה יותר. זרוק את שמן הטבילה לשקופית, הימנע מתנועה בזמן טפטוף כדי למנוע היווצרות בועות. הזז את ידית עדשת המיקרוסקופ כך שהעדשה האובייקטיבית תיכנס למקומה ויגע בשמן.
ניתן להשתמש בטבילת שמן רק על עדשות מעוצבות במיוחד, לא על עדשות "יבשות"
שלב 2. נסה לזהות חיידקים גרם חיוביים ושליליים גרם
בחן את השקופית מתחת למיקרוסקופ אור. חיידקים חיוביים לגראם מופיעים בצבע סגול, כיוון שסגול הגביש נלכד בתוך דופן התא העבה. חיידקים שליליים של גראם יהיו בצבע ורוד או אדום, כיוון שהסגול הקריסטלי נשטף החוצה מבעד לדפנות התא הדקיקות, אליהן נכנס צבע הנגד הוורוד.
- אם המדגם סמיך מדי, התוצאה עלולה להיות חיובית שווא. כתם דגימה חדשה אם היא מראה את כל החיידקים החיוביים גרם, כדי לוודא שהתוצאה נכונה.
- אם אתה משתמש יותר מדי אקונומיקה צבעונית, התוצאה יכולה להיות שלילית שווא. כתם דגימה חדשה אם היא מציגה את כל החיידקים השליליים גרם, כדי לוודא שהתוצאה נכונה.
שלב 3. השווה את התוצאות שאתה רואה עם תמונת ההפניה
אם אינך יודע כיצד נראים חיידקים, למד את אוסף תמונות ההתייחסות, הממוינות בדרך כלל לפי צורה וכתם גראם. תוכל גם לצפות במאגרי מידע מקוונים ב [מסד הנתונים הלאומי של פתוגנים של חיידקים, חיידקים בתמונות, ואתרים מקוונים רבים אחרים. כדי להקל על הזיהוי, להלן דוגמאות לחיידקים הנפוצים בהם או החשובים לאבחון, המסווגים על פי מצב הגראם שלהם וצורתם.
שלב 4. זיהוי חיידקים חיוביים גרם על בסיס צורתם
חיידקים מסווגים עוד יותר על פי צורתם מתחת למיקרוסקופ, לרוב כקאצי (כדוריים) או מוטות (גליליים). להלן מספר דוגמאות לחיידקים חיוביים גרם (בצבע סגול) על פי צורתם:
- קוקסי חיוביים גרם בדרך כלל staphylococci (כלומר קוקי קבוצה) או סטרפטוקוקים (כלומר cocci שרשרת).
- מוטות חיוביות גרם כגון Bacillus, Clostridium, Corynebacterium ו- Listeria. חיידק המוט Actinomyces spp. בדרך כלל יש ענפים או נימים.
שלב 5. זיהוי חיידקים שליליים גרם
חיידקים שליליים (בצבע ורוד) מסווגים לרוב לשלוש קבוצות. קוקוסים בצורת כדור, מוטות ארוכים ודקים, בעוד מוטות קוקו נמצאים בין לבין.
- קוקסי שלילי הנפוץ ביותר הוא Neisseria spp.
- מוטות גראם שליליים למשל E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, ועוד רבים אחרים. ניתן לראות את Vibrio cholerae כגבעול רגיל או כגבעול כפוף.
- חיידקי מוט "קוקוקויד" (או "קוקוקבצילי") שליליים למשל Bordetella, Brucella, Haemophilus ו- Pasteurella
שלב 6. בדוק היטב אם התוצאות מעורבות
לחלק מהחיידקים קשה לצבוע במדויק, בשל השבריריות או האופי השעוות של קירות התא שלהם. חיידקים אלה עשויים להראות תערובת של סגול או ורוד באותו תא, או בין תאים שונים באותו מריחה. דגימות חיידקים מעל גיל 24 שעות יכולות להראות בעיה זו, אך ישנם גם כמה מיני חיידקים שנשארים קשים לצביעה בכל גיל הדגימה. חיידקים אלה דורשים בדיקות מיוחדות יותר לזיהוי, כגון צביעה מהירה של חומצה, תצפית בתרבית חיידקים, אמצעי תרבות TSI או בדיקות גנטיות.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium ו- Propionibacterium spp. כולם חיידקים חיוביים לגרם, אך לרוב אינם מוכתמים בצורה ברורה.
- חיידקים קטנים ודקים כגון טרפונמה, כלמידיה ו Rickettsia spp. קשה להכתים בשיטת Gram.
שלב 7. השלך את כל החומרים המתכלים והציוד הנותרים
הליך פינוי פסולת זה משתנה בין מעבדות ותלוי בחומרים בהם משתמשים. בדרך כלל, הנוזל במגש הצביעה נזרק בבקבוקים המסומנים כפסולת מסוכנת. משרים שקופיות בתמיסת אקונומיקה של 10%, ואז זורקים לכלי חד.
טיפים
- זכור שתוצאות כתמי הגראם יהיו טובות רק אם המדגם טוב. חשוב ליידע את המטופלים על מנת שיוכלו לספק דגימה טובה (למשל, ההבדל בין יריקה לעומת שיעול עמוק כדי להשיג דגימת ליחה).
- כאקונומיקה צבעונית, אתנול מגיב לאט יותר מאשר אצטון.
- הקפד על תקנות מעבדה סטנדרטיות כדי להבטיח בטיחות.
- תרגלו בעזרת ספוגית לחיים כי הם מכילים חיידקים חיוביים גרם וגם שליליים. אם אתה רואה רק סוג אחד של חיידקים, ייתכן שאתה משתמש בפחות מדי או יותר מדי אקונומיקה.
- אתה יכול להשתמש בסוגריים מעץ לאבטחת השקופית.
אַזהָרָה
- אצטון ואתנול הם חומרים דליקים. האצטון יסיר את השמן מידיך, ויקל על העור שלך לספוג כימיקלים אחרים. הרכיבו כפפות והשתמשו בהן בזהירות.
- אל תיתן למריחה להתייבש לפני שתשטוף את כתם הגראם או כתם נגד.
מה אתה צריך
- דוגמא לרשת
- מגלשת זכוכית
- פִּיפֵּטָה
- מקור אש קטן, או מחמם שקופיות, או מתנול
- מים
- סגול קריסטל
- יוֹד
- צבע אקונומיקה, כגון אלכוהול או אצטון
- ספראנין
